發(fā)表在《Aging》高壓氧增加端粒長度并減少分離血細(xì)胞的免疫衰老：一項(xiàng)前瞻性試驗(yàn)

抽象的

簡介：衰老的特點(diǎn)是生理能力的逐漸喪失。在細(xì)胞水平上，衰老過程的兩個(gè)關(guān)鍵標(biāo)志包括端粒長度 (TL) 縮短和細(xì)胞衰老。使用某些高壓氧療法 (HBOT) 協(xié)議重復(fù)間歇性高氧暴露可以誘導(dǎo)再生效應(yīng)，這通常發(fā)生在缺氧期間。本研究的目的是評估 HBOT 是否影響正常、非病理性、老齡化成年人群中的 TL 和衰老細(xì)胞濃度。

方法：招募了 35 名 64 歲及以上的健康獨(dú)立生活成年人，每天接受 60 次 HBOT 暴露。在基線、第 30^次和^第60^次會話以及最后一次 HBOT 會話后 1-2 周收集全血樣本。評估了外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC) 端粒長度和衰老。

結(jié)果： HBOT 后，T 輔助細(xì)胞、T 細(xì)胞毒性細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和 B 細(xì)胞的端粒長度顯著增加了 20% 以上。最顯著的變化出現(xiàn)在 B 細(xì)胞中，在第 30^次、^第60^次和 HBOT 后增加了 25.68%±40.42 (p=0.007)、29.39%±23.39 (p=0.0001) 和 37.63%±52.73 (p) =0.007)，分別。

HBOT后衰老T輔助細(xì)胞的數(shù)量顯著減少-37.30%±33.04（P<0.0001）。T 細(xì)胞毒性衰老細(xì)胞百分比在 HBOT 后顯著降低 -10.96%±12.59 (p=0.0004)。

總之，該研究表明，HBOT 可能會誘導(dǎo)顯著的衰老作用，包括顯著增加端粒長度和老齡化人群中衰老細(xì)胞的清除。

介紹

衰老的特征在于生理完整性的逐漸喪失，導(dǎo)致功能受損以及疾病和死亡的易感性。這種生物退化被認(rèn)為是癌癥、心血管疾病、糖尿病和阿爾茨海默病等的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。在細(xì)胞水平上，衰老過程有兩個(gè)關(guān)鍵標(biāo)志：端粒長度縮短和細(xì)胞衰老 [ 1 ]。

端粒是位于染色體末端的串聯(lián)核苷酸重復(fù)序列，可維持基因組的穩(wěn)定性。由于固有的無法完全復(fù)制滯后 DNA 鏈的末端部分，端粒在復(fù)制（有絲分裂）過程中會縮短 [ 2 ]。端粒長度（TL），4至15個(gè)堿基之間測量，逐漸縮短每年由?20-40個(gè)堿基，并與不同的疾病，低物理性能和大腦[的皮質(zhì)變薄相關(guān)聯(lián)3 - 5 ]。當(dāng) TL 達(dá)到臨界長度時(shí)，細(xì)胞無法復(fù)制并進(jìn)入衰老或程序性細(xì)胞死亡 [ 6 ]。戈格林等人。證明具有較短 TL 的成年人死亡率增加 [ 7]]。縮短的 TL 可能是直接遺傳特征，但一些環(huán)境因素也與縮短 TL 相關(guān)，包括壓力、缺乏體力活動、體重指數(shù)過高、吸煙、慢性炎癥、維生素缺乏和氧化應(yīng)激 [ 2 , 8 , 9] ]。

細(xì)胞衰老是細(xì)胞周期的停滯，這可能由端?？s短 [ 10 ] 以及其他與 TL 無關(guān)的衰老相關(guān)刺激引起，例如非端粒 DNA 損傷 [ 1 ]。衰老的主要目的是通過免疫系統(tǒng)觸發(fā)它們的消除來防止受損細(xì)胞的繁殖。衰老細(xì)胞隨著衰老而積累，反映了這些細(xì)胞生成的增加和/或清除率的降低，這反過來又會加劇損傷并促進(jìn)衰老[ 1 ]。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)了幾種可以降低端?？s短率的藥物 [ 11 , 12 ]。包括耐力訓(xùn)練、飲食和針對細(xì)胞代謝和氧化應(yīng)激的補(bǔ)充劑在內(nèi)的幾種生活方式干預(yù)措施對 TL ^{3 的}影響相對較小 (2-5%) ^， [ 2 , 8 , 9 ]。

高壓氧療法 (HBOT) 在高于一個(gè)絕對大氣壓 (ATA) 的環(huán)境壓力下利用 100% 的氧氣來增加溶解在身體組織中的氧氣量。重復(fù)間歇性高氧暴露，使用某些 HBOT 協(xié)議，可以誘發(fā)生理效應(yīng)，這通常發(fā)生在高氧環(huán)境中的缺氧期間，即所謂的高氧缺氧悖論 [ 13 – 16 ]。此外，最近證明 HBOT 可以通過涉及腦血流區(qū)域變化的機(jī)制誘導(dǎo)健康老年人的認(rèn)知增強(qiáng) [ 17]]。在細(xì)胞水平上，已證明 HBOT 可誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子 (HIF)、血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF) 和沉默調(diào)節(jié)蛋白 (SIRT)、干細(xì)胞增殖、線粒體生物發(fā)生、血管生成和神經(jīng)發(fā)生的表達(dá) [ 18 ]。然而，迄今為止還沒有研究檢查過 HBOT 對 TL 和衰老細(xì)胞積累的影響。

本研究的目的是評估 HBOT 是否影響老年人的 TL 和衰老樣 T 細(xì)胞群。

結(jié)果

35 個(gè)人被分配到 HBOT。五名患者未完成基線評估并被排除在外。完成基線評估的所有 30 名患者均完成了干預(yù)。由于血液樣本質(zhì)量低（細(xì)胞數(shù)量少或技術(shù)人員錯(cuò)誤），4 名患者被排除在端粒分析之外，10 名患者被排除在衰老細(xì)胞分析之外（圖 1）。表1中提供了排除患者后隊(duì)列的基線特征和比較。三組之間沒有顯著差異（表1）。

圖 1. 患者流程圖。

表 1. 基線特征。

		熱電偶	端粒分析	衰老分析	P值
N		30	25 (83.3%)	20 (66.6%)
年齡（歲）		68.41±13.2	67.56±14.35	66.70±16.00	0.917
體重指數(shù)		26.77±3.20	26.89±3.34	27.14±3.81	0.946
男性		16 (53.3%)	13 (52.0%)	10 (50.0%)	0.987
女性		14 (47.7%)	12 (48.0%)	10 (50.0%)	0.987
全血細(xì)胞計(jì)數(shù)
	血紅蛋白	6.33±1.25	6.57±1.15	6.58±1.29	0.707
	白血細(xì)胞	14.02±1.40	13.92±1.35	13.97±1.49	0.969
	%PBMC	39.96±6.75	39.25±6.64	38.59±6.63	0.774
	血小板	239.87±1.39	244.08±43.0	254.05±41.4	0.559
慢性病
	心房顫動	4 (13.3%)	4 (16.0%)	2 (10.0%)	0.841
	甲狀腺功能減退癥	4 (13.3%)	4 (16.0%)	3 (15.8%)	0.956
	阻塞性睡眠呼吸暫停	4 (13.3%)	4 (16.0%)	3 (15.0%)	0.961
	哮喘	1 (3.3%)	1 (4.0%)	0	0.680
	前列腺增生癥	7 (23.3%)	5 (20.0%)	6 (30.0%)	0.733
	GERD	3 (10%)	2 (8.0%)	2 (10.0%)	0.961
	骨質(zhì)疏松癥	5 (16.7%)	5 (20.0%)	4 (20.0%)	0.936
	風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎	1 (3.3%)	0	1 (5.0%)	0.561
	骨關(guān)節(jié)炎	7 (23.3%)	4 (16.0%)	5 (25.0%)	0.755
	糖尿病	3 (10%)	3 (12.0%)	2 (10.0%)	0.966
	高血壓	7 (23.3%)	5 (20.0%)	5 (25.0%)	0.918
	血脂異常	16 (53.3%)	14 (56.0%)	12 (60.0%)	0.897
	缺血性心臟病	2 (6.7%)	1 (4.0%)	2 (10.0%)	0.725
	吸煙史	10 (33.3%)	8 (32.0%)	7 (35.0%)	0.978
慢性藥物
	反聚合	8 (26.7%)	6 (24.0%)	5 (25.0%)	0.974
	ACE抑制劑/ARB阻滯劑	6 (20%)	6 (24.0%)	6 (30.0%)	0.720
	β受體阻滯劑	5 (16.7%)	5 (20.0%)	3 (15.0%)	0.901
	鈣阻滯劑	3 (10%)	3 (12.0%)	2 (10.0%)	0.966
	阿爾法受體阻滯劑	7 (23.3%)	5 (20.0%)	6 (30.0%)	0.733
	利尿劑	2 (6.7%)	1 (4.0%)	1 (5.0%)	0.906
	他汀類藥物	10 (33.3%)	9 (36.0%)	7 (35.0%)	0.978
	口服降糖藥	1 (3.3%)	1 (4.0%)	1 (5.0%)	0.958
	雙膦酸鹽	1 (3.3%)	1 (4.0%)	1 (5.0%)	0.958
	質(zhì)子泵抑制劑	3 (10%)	3 (12.0%)	3 (15.0%)	0.726
	激素	3 (10%)	3 (12.0%)	2 (10.0%)	0.966
	苯二氮卓類	3 (10%)	2 (8.0%)	1 (5.0%)	0.816
	SSRI	5 (16.7%)	5 (20.0%)	3 (15.0%)	0.990

端粒長度

與基線相比，第 30^次和 HBOT 后T 輔助端粒長度顯著增加21.70±40.05 (p=0.042)、23.69%±39.54 (p=0.012) 和 29.30±38.51 (p=0.00) ），分別（圖2）。然而，重復(fù)測量分析顯示出不顯著的趨勢（F=4.663，p=0.06，表 2和圖 2）。

圖 2. 端粒長度隨 HBOT 的變化。平均值+SEM *p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

表 2. HBOT 后端粒長度和衰老細(xì)胞的變化。

		絕對的變化				相對變化 (%)			重復(fù)測量 F (p)
PBMC	基線	第30屆		第60屆會議	后 HBOT	第30屆	第60屆會議	后HBOT
PBMC ((N=25)	2.55±0.53				-0.15±0.40			-4.91±16.70	1.987 (噸) 0.09
PBMC (N=20)	2.50±0.53				-0.13±0.31			-4.21±11.99	1.810 (噸) 0.07
相對端粒長度 (N=25)
自然殺手	9.27±1.91	11.77±5.14 (0.045)		10.73±2.73 (0.013)	11.75±4.22 (0.06)	25.02±51.42	20.56±33.35	22.16±44.81	0.812 (0.391)
B細(xì)胞	8.36±2.02	10.22±3.04 (0.007)		11.23±3.58 (0.0001)	11.17±2.98 (0.007)	25.68±40.42	29.39±23.39	37.63±52.73	7.390 (0.017)
幫手	8.04±1.82	9.92±3.68 (0.042)		9.63±2.17 (0.012)	10.20±2.77 (0.005)	21.70±40.05	23.69±39.54	29.30±38.51	4.663 (0.063)
細(xì)胞毒	8.26±1.54	9.83±4.08 (0.11)		10.08±3.33 (0.019)	10.15±2.74 (0.023)	18.29±45.62	24.13±40.88	19.59±33.98	1.159 (0.310)
衰老細(xì)胞（T 細(xì)胞的百分比）（N=20）
幫手	10.29±5.42	7.84±7.09 (0.09)		8.51±7.45 (0.20)	6.22 ± 4.88 (< 0.0001 )	-19.66±80.03	-11.67±94.30	-37.30±33.04	8.548 (0.01)
細(xì)胞毒	52.19±21.07	45.53 ± 19.91 (< 0.0001 )		45.45±18.81 (0.002)	46.59±21.91 (0.0004)	-12.21±8.74	-9.81±9.50	-10.96±12.59	6.916 (0.018)
() 中顯示的 P 值與基線相比。
粗體的 P 值 <0.05。

與基線相比，B 細(xì)胞的端粒長度在第 30^次、^第60^次和 HBOT 后顯著增加25.68%±40.42（p=0.007）、29.39%±23.39（p=0.0001）和 37.63%±52.73（ p=0.007），分別（圖2）。重復(fù)測量分析顯示了顯著的組內(nèi)效應(yīng)（F=0.390，p=0.017，表 2和圖 2）。

與基線相比，自然殺傷細(xì)胞端粒長度在第 30^次會議 (p=0.045) 和第 60^次會議時(shí)顯著增加了 20.56% ±33.35 (p=0.013)。HBOT 后，端粒長度在 HBOT 后增加了 22.16%±44.81（p=0.06，表 2和圖 2）。重復(fù)測量分析表明，在第 30^次會議后沒有額外的顯著影響（F=0.812，p=0.391）。

與基線相比，細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞在第 30^次會話時(shí)無顯著增加18.29%±45.62 (p=0.11)，隨后在第 60^次會話時(shí)顯著增加 24.13%±40.88 (p=0.0019) HBOT 后為 19.59%±33.98（p=0.023）。重復(fù)測量分析表明，在第 30^次會議后沒有額外的顯著影響（F=1.159，p=0.310，表 2和圖 2）。

衰老細(xì)胞

第 30^次和^第60^次的衰老 T-helper 數(shù)量分別下降-19.66%±80.03 (p=0.09) 和 -11.67%±94.30 (p=0.20)。然而，HBOT后衰老T輔助細(xì)胞的數(shù)量顯著下降-37.30%±33.04（P<0.0001，圖3）。重復(fù)測量分析表明，即使在第 30^次會議之后，仍具有顯著的持續(xù)效應(yīng)，具有組內(nèi)效應(yīng)（F=8.547，p=0.01，表 2和圖 3）。

圖 3. HBOT 引起的衰老細(xì)胞變化。平均值+SEM *p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

T 細(xì)胞毒性衰老細(xì)胞百分比在第 30^次HBOT 會話時(shí)顯著下降 -12.21%±8.74 (P<0.0001)，在^第60^次HBOT 會話時(shí)-9.81%±9.50 (0.002) 和 -10.96%±12.59 (p=0.000) ）后 HBOT（表 2和圖 3）。重復(fù)測量分析顯示即使在第 30^次會議之后仍具有顯著的持續(xù)效應(yīng)，具有組內(nèi)效應(yīng)（F=6.916，p=0.018，表 2）。

HIF-1α

HIF-1alpha 水平在第 60^次會議時(shí)從 10.54±3.39 增加到 19.71±3.39 (p=0.006)，其中 HBOT 后 2 周水平 16.81±7.65 與基線沒有顯著差異 (p=0.16)。

討論

在這項(xiàng)研究中，首次在人類中發(fā)現(xiàn)重復(fù)的每日 HBOT 會話可以使老齡化人群的 PBMC 端粒長度增加 20% 以上，其中 B 細(xì)胞的變化最為顯著。此外，HBOT 將衰老細(xì)胞的數(shù)量減少了 10-37%，其中 T 輔助衰老細(xì)胞受到的影響最大。

已經(jīng)觀察到端粒長度和生活方式改變之間存在大量關(guān)聯(lián)。這導(dǎo)致了幾項(xiàng)干預(yù)性研究，其中包括飲食、補(bǔ)充劑（如 omega-3 和核桃等）、體育鍛煉、壓力管理和社會支持。一項(xiàng)對認(rèn)知健康的老年人使用富含核桃的飲食進(jìn)行的為期兩年的試驗(yàn)顯示，與對照飲食相比，保留端粒長度的趨勢不顯著 [ 19 ]。在另一項(xiàng)評估老年人 12 周低頻爆發(fā)式抗阻訓(xùn)練效果的研究中，干預(yù)組的端粒長度得到更好的保留，而沒有顯著增加 [ 20]]。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，六個(gè)月的有氧耐力訓(xùn)練或高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練可使端粒長度增加 5% [ 21 ]。額外的減肥、瑜伽和壓力管理技術(shù)未能顯示出顯著的端粒長度變化 [ 22 – 25 ]。然而，大多數(shù)這些研究已顯示抗氧化活性和端粒酶活性[之間顯著相關(guān)性22 - 25 ]。

雖然許多遺傳和環(huán)境因素與端?？s短有關(guān)，但最常見的機(jī)制是氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激可能由活性氧 (ROS) 的產(chǎn)生與細(xì)胞清除劑之間的不平衡引起。端粒對氧化性 DNA 損傷高度敏感，可導(dǎo)致端?？s短和功能障礙 [ 26 ]。在過去的幾十年里，氧和/或氧化應(yīng)激與端粒長度之間的關(guān)聯(lián)一直存在爭議。人類細(xì)胞培養(yǎng)研究一致表明，輕度氧化應(yīng)激會加速端?？s短，而抗氧化劑和自由基清除劑會降低端?？s短率并延長細(xì)胞增殖壽命 [ 27]]。多項(xiàng)關(guān)于病理狀況（如糖尿病、炎癥性疾病、帕金森?。┑呐R床研究表明，氧化應(yīng)激標(biāo)志物、活性氧清除劑水平和端粒長度之間存在相關(guān)性 [ 28 ]。然而，健康個(gè)體并沒有表現(xiàn)出類似的結(jié)果 [ 29 ]。

以前曾有人建議將細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于高壓環(huán)境中會誘導(dǎo)顯著的氧化應(yīng)激和細(xì)胞過早衰老 [ 30 ]。然而，這是基于在高壓培養(yǎng)箱中生長的分離細(xì)胞，而不是本研究中人類復(fù)雜的生物系統(tǒng)。與目前的研究類似，之前對暴露于強(qiáng)高壓氧的潛水員進(jìn)行的一項(xiàng)為期一年的前瞻性觀察研究表明，白細(xì)胞的端粒顯著延長 [ 31 ]。正如當(dāng)前研究中所使用的，HBOT 協(xié)議利用了重復(fù)間歇性高氧暴露引起的影響，即所謂的高氧缺氧悖論 [ 13 , 18]]。這些間歇性高氧暴露誘導(dǎo)了一種適應(yīng)性反應(yīng)，其中包括抗氧化劑基因 [ 32 ] 的上調(diào)增加和抗氧化劑/清除劑的產(chǎn)生，這些抗氧化劑/清除劑適應(yīng)增加的 ROS 生成，導(dǎo)致 ROS/清除劑比率逐漸變得與正常氧氣環(huán)境下的比率相似。然而，由于清除劑消除半衰期 (T _1/2 ) 顯著長于ROS的 T _1/2，在恢復(fù)到常氧后，重復(fù)高氧暴露后，清除劑水平顯著升高，抗氧化活性增加 [ 13] , 18]。因此，類似于體育鍛煉和熱量限制，每天重復(fù)的 HBOT 方案可以誘發(fā)興奮現(xiàn)象。單次暴露會急劇增加 ROS 的產(chǎn)生，觸發(fā)抗氧化反應(yīng)，而重復(fù)暴露后，反應(yīng)變得保護(hù)性 [ 13 , 18 ]。

此外，間歇性高氧暴露會誘發(fā)許多在缺氧期間發(fā)生的生理反應(yīng) [ 13 ]。HBOT 誘導(dǎo)稱為缺氧誘導(dǎo)因子 (HIF) 的轉(zhuǎn)錄因子的釋放，并增加其穩(wěn)定性和活性 [ 14 ]。反過來，HIF 誘導(dǎo)細(xì)胞級聯(lián)反應(yīng)，包括血管內(nèi)皮生長因子和血管生成誘導(dǎo)、線粒體生物發(fā)生、干細(xì)胞動員和 SIRT1 活性增加 [ 18 ]。我們的研究證實(shí)，HIF 表達(dá)增加是由重復(fù)的 HBOT 暴露誘導(dǎo)的，在非單一環(huán)境下，HIF 水平逐漸降低，趨向于正?；?/span>

目前，許多通過基因或藥理學(xué)（senolytic 藥物）去除衰老細(xì)胞的干預(yù)措施已在動物模型中開發(fā)出來，正在等待對人體的安全性和有效性評估 [ 33 ]。目前的研究提出了一種非藥物方法，臨床上可用且安全性良好，可減少衰老細(xì)胞數(shù)量。我們的協(xié)議包括 2 ATA 的 60 次 100% 氧氣會話，包括每次會話期間的 3 次空氣中斷，以利用高氧缺氧悖論并最大限度地減少氧中毒的風(fēng)險(xiǎn)。有趣的是，TL和衰老細(xì)胞減少峰值在30^個(gè)會議。然而，與施加的壓力、時(shí)間和 HBOT 暴露次數(shù)相關(guān)的劑量反應(yīng)曲線及其與 HIF 表達(dá)及其相關(guān)再生效應(yīng)的關(guān)系仍未完全了解，需要進(jìn)一步研究以找到最佳的 HBOT 方案。

高壓氧療法是一種成熟的治療方式，可用于治療不愈合傷口、放射損傷以及不同的缺氧或缺血事件（如一氧化碳中毒、感染等）。近年來，從臨床前一個(gè)越來越多的證據(jù)以及臨床試驗(yàn)表明高壓氧用于治療神經(jīng)適應(yīng)癥，包括特發(fā)性突發(fā)性感覺神經(jīng)性聽力損失[功效34 ]，卒中后和后創(chuàng)傷性腦損傷[ 35 - 41 ]，中樞致敏綜合征例如纖維肌痛綜合征 [ 42 , 43 ] 和與年齡相關(guān)的認(rèn)知能力下降 [ 17 ] 和阿爾茨海默病的動物模型 [ 44]]。目前的研究首次旨在評估在沒有任何功能限制性疾病的情況下對衰老人類細(xì)胞水平的生理影響。

研究限制

目前的研究有幾個(gè)局限性和優(yōu)勢需要考慮。首先，必須考慮有限的樣本量。二是缺乏對照組。然而，該研究表明在 TL 和衰老細(xì)胞清除方面取得了令人印象深刻的結(jié)果，這在其他干預(yù)措施中沒有觀察到。此外，我們隊(duì)列的基線端粒長度值與老齡化人口的預(yù)期值相匹配 [ 45 – 47]。第三，效果的持續(xù)時(shí)間還有待長期隨訪確定。第四，由于選擇了用于血液保存和評估的方法，未評估端粒酶活性。然而，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)幾個(gè)優(yōu)勢。在這項(xiàng)研究中，CD28 被用作衰老細(xì)胞的生物標(biāo)志物，而 CD57 不能用作 T 細(xì)胞衰老的確認(rèn)標(biāo)志物。生物標(biāo)志物是針對特定的白細(xì)胞群進(jìn)行評估的，而不是使用整個(gè) PBMC 作為一組。測量了孤立的 HBOT 效應(yīng)，并監(jiān)測參與者沒有進(jìn)行任何生活方式改變（例如營養(yǎng)和運(yùn)動）、藥物治療或任何其他可能作為混雜因素的干預(yù)。

總之，該研究表明，HBOT 可以誘導(dǎo)顯著的衰老作用，包括顯著增加端粒長度和清除衰老細(xì)胞中的衰老細(xì)胞。

材料和方法

科目

招募了 35 名沒有病理性認(rèn)知能力下降的成年人，年齡在 64 歲及以上，獨(dú)立生活，功能和認(rèn)知狀態(tài)良好。該研究于 2016 年至 2020 年在以色列 Shamir (Assaf-Harofeh) 醫(yī)療中心進(jìn)行。納入的患者在納入之前的最后一年沒有心臟或腦血管缺血史。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：過去三個(gè)月因任何原因接受過 HBOT 治療，過去一年有任何惡性腫瘤病史，任何病理性認(rèn)知能力下降，嚴(yán)重慢性腎功能衰竭（GFR <30），未控制的糖尿?。℉bA1C>8，禁食）葡萄糖>200）、免疫抑制劑、MRI禁忌癥（包括BMI>35）、主動吸煙或肺部疾病。

學(xué)習(xí)規(guī)劃

該研究方案得到了以色列沙米爾醫(yī)療中心機(jī)構(gòu)審查委員會的批準(zhǔn)。該研究是作為一項(xiàng)前瞻性臨床試驗(yàn)進(jìn)行的。在簽署知情同意書并進(jìn)行基線評估后，受試者被分配到 HBOT。測量點(diǎn)在基線、治療方案的半點(diǎn)（^第30^次療程）、最后一次 HBOT療程的當(dāng)天和 HBOT 后 1-2 周進(jìn)行評估。

該研究隊(duì)列僅包括接受 HBOT 治療的患者，這是在以色列 Shamir 醫(yī)療中心研究的更大的正常老齡化人群隊(duì)列的一部分 (NCT02790541 [ 17 ])。

干預(yù)

HBOT 方案在 Multiplace Starmed-2700 室（HAUX，德國）中進(jìn)行。該協(xié)議包括 60 個(gè)每日會話，三個(gè)月內(nèi)每周 5 個(gè)會話。每次訓(xùn)練包括在 2ATA 通過面罩呼吸 100% 氧氣 90 分鐘，每 20 分鐘呼吸 5 分鐘。壓縮/減壓速率為1米/分鐘。在試驗(yàn)期間，不允許改變生活方式和飲食，也不允許調(diào)整藥物。

血液樣本

使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將全血樣本收集到 EDTA 管中，在基線、HBOT 方案的半點(diǎn)（^第30^次會話）、最后一次 HBOT 會話的當(dāng)天（^第60^次會話）和HBOT 會話后的1-2 周上次 HBOT 會議。

外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC) 分離

使用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 稀釋全血。使用裝有 Lymphoprep 的 Leucosep 管進(jìn)行密度梯度分離。然后將管在 25°C 下以 1000 x g離心10 分鐘。離心后，立即通過移液管收集細(xì)胞層（血沉棕黃層）并轉(zhuǎn)移到 50 mL 錐形離心管中，用足量的 1X PBS 重懸至 50 mL，并在 25°C 度下以 300× g離心10 分鐘。去除上清液后，對每個(gè)樣品進(jìn)行標(biāo)記。

端粒長度

根據(jù) Dako PNA/FITC 試劑盒協(xié)議（代碼 K5327）標(biāo)記端粒。在由 PBMC（樣品細(xì)胞）和 TCL 1301 細(xì)胞系（對照細(xì)胞）的混合物組成的單細(xì)胞懸液上，DNA 在微量離心管中在 82°C 下變性 10 分鐘，在沒有探針的雜交溶液中或在含有熒光素偶聯(lián)的 PNA 端粒探針的雜交溶液中。雜交在室溫 (RT) 下在黑暗中進(jìn)行過夜。雜交后用 40°C 的洗滌液進(jìn)行兩次 10 分鐘的雜交后洗滌。然后在適當(dāng)?shù)木彌_液中用 CD4+、CD8+、CD3+、CD19+ 和 CD56+ 偶聯(lián)抗體標(biāo)記樣品，以進(jìn)行進(jìn)一步的流式細(xì)胞術(shù)分析 [ 48 , 49]。每個(gè)樣品一式兩份運(yùn)行。流式細(xì)胞術(shù)分析后，計(jì)算 CD3+/CD4+（T 輔助細(xì)胞）、CD3+/CD8+（T-細(xì)胞毒性）、CD3+/CD56+（自然殺傷細(xì)胞）和 CD19+（B 細(xì)胞）的相對端粒長度 (RTL)。RTL 值計(jì)算為每個(gè)樣品的端粒信號與對照細(xì)胞（TCL 1301 細(xì)胞系）的比值，并校正 G0/1 細(xì)胞的 DNA 指數(shù)。使用碘化丙啶染色分別分析樣品細(xì)胞和對照細(xì)胞的 DNA 倍性，以標(biāo)準(zhǔn)化每個(gè)細(xì)胞的端粒末端數(shù)量，從而標(biāo)準(zhǔn)化每個(gè)染色體的端粒長度。有關(guān)FACS 分析示例，請參見圖 4。

圖 4. T helper 亞群的 Flow Fish 數(shù)據(jù)分析示例。在數(shù)據(jù)采集之前，每個(gè)血樣都用 PNA 探針 ( b ) 或不使用 ( a ) 染色，然后進(jìn)行抗體染色（CD3、CD4、CD8、CD16、CD19）。

免疫表型

CD3+CD4+CD28-null T 細(xì)胞（衰老 T 輔助細(xì)胞）和 CD3+CD8+CD28-null T 細(xì)胞（衰老 T 細(xì)胞毒物）的百分比通過流式細(xì)胞術(shù)分析確定。PBMC 用 VioBlue 偶聯(lián)抗 CD3、Viogreen 偶聯(lián)抗 CD8、PE-VIO 770A 偶聯(lián)抗 CD4 和 APC-VIO 770A 抗 CD28 抗體（Miltenyi Biotec）染色。用 MACSQuant 流式細(xì)胞儀 (Miltenyi Biotec) 分析細(xì)胞。然后計(jì)算 CD4+ 或 CD8+ T 細(xì)胞群中 CD28null T 細(xì)胞的百分比。

缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1alpha）

在固定和透化（Life Technologies）后，用 APC 偶聯(lián)的抗 HIF1a 抗體或相應(yīng)的同種型對照（研發(fā)系統(tǒng)）進(jìn)行細(xì)胞內(nèi) HIF1a 染色。用 MACSQuant 流式細(xì)胞儀 (Miltenyi Biotec) 分析細(xì)胞，并確定表達(dá) HIF1a 的 PBMC 的百分比。

統(tǒng)計(jì)分析

除非另有說明，連續(xù)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用 Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)測試所有變量的正態(tài)分布。進(jìn)行單向方差分析以比較基線時(shí)三組之間和三組內(nèi)的變量。

分類數(shù)據(jù)以數(shù)字和百分比表示，并通過卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較。使用卡方/費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn)進(jìn)行單變量分析以確定顯著變量（P<0.05）。

為了評估 HBOT 的效果，使用重復(fù)測量方差分析模型來測試主要的受試者內(nèi)效應(yīng)。對均值進(jìn)行事后檢驗(yàn)以使用帶有 Bonferroni 校正的 t 檢驗(yàn)來檢驗(yàn)時(shí)間差異。

作者貢獻(xiàn)

所有作者都為本手稿的準(zhǔn)備做出了重大貢獻(xiàn)。HY、HA、ES 負(fù)責(zé)協(xié)議設(shè)計(jì)。HA、ZY、BY、ES、DKM 負(fù)責(zé)患者招募。YH、AHR、SM、YY、SM、ZR、ESW、HA、DKM、SG、BGR、DG、HY、AHR、FG、LE、PN、DK、FM、ZY、BY負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)采集。哈，哈。ES負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析。所有作者都解釋了數(shù)據(jù)。HY、HA、CM 和 ES 撰寫了手稿。所有作者都修改并完成了手稿。

致謝

我們要感謝 Mechael Kanovsky 博士對這份手稿的編輯。

利益沖突

AH, BY, ZY 為 AVIV Scientific LTD 工作。ES 是 AVIV Scientific LTD 的股東。

資金

該研究由 Sami Sagol 先生建立的 Sagol 神經(jīng)科學(xué)網(wǎng)絡(luò)的研究資助資助。

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